單細胞基因組測序

經典案例

案例一 單精子全基因組測序探索染色體重組

Probing Meiotic Recombination and Aneuploidy of Single
Sperm Cells by Whole-Genome Sequencing

期刊:Science
影響因子:33.611
發表單位:北京大學
發表年份:2012年12月

一、研究背景

減數分裂期間同源染色體之間存在片段交叉重組(crossover)事件,染色體重組意味著遺傳物質的分離交換,是產生生物多態性的重要遺傳機制。在全基因組范圍內,重組位點并非均勻分布,而是集中在一些散布的狹小區域內(hotspot),并且不同物種以及同一物種不同個體重組位點也存在明顯差異。

傳統的人類染色體重組研究,采用染色體核型分析技術,受實驗技術的限制,分辨率較低;另外,由于一個家庭內的孩子數目有限,以往的研究都是在群體水平上開展的,而無法開展個人水平的遺傳重組規律研究。單細胞DNA擴增技術和高通量測序技術的發明,使得測序單個精子的基因組成為可能。

二、方法流程

取材

對一名亞洲男性及其99個精子進行了單細胞全基因組測序

測序

1. Illumina HiSeq 2000
2. 單細胞全基因組測序:
體細胞(70×);
93個精子(1×);
6個精子(5×)。

分析

1. 與人類參考基因組(hg19)進 行比對
2. SNP檢測
3. 單體型分析

三、研究結果

1. SNP檢測及重組定位

檢測到SNP約2.8M個,其中約1.4M個為雜合SNP。同時分析變異計算重組率,約1.1M的雜合SNP進行了定位,構建了迄今為止重組定位精度最高的個人遺傳圖譜,定位的準確率為99.5%。研究發現個體水平上基因區附近的重組率有降低的現象,證明了這一現象是由分子機制決定,而非自然選擇的結果。

2. 染色體非整倍性

本研究還發現5%的精子(4個)染色體數目發生異常,即染色體組非整倍體。其中S39精子的19號染色體發生了缺失,S39精子的6號染色體發生了二倍化。前人研究表明,染色體數目異常是造成某些先天性出生缺陷的重要原因。

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四、研究結論

本研究采用最新發明的多重退火環狀擴增循環技術(MALBAC),對一名亞洲男性及其99個精子進行了組織及單細胞全基因組測序,測序深度分別為70×和1×,構建了個人遺傳圖譜,并分析減數分裂期間同源染色體之間的片段交叉重組(crossover)事件。研究表明個體水平上基因區附近的重組率降低現象是由分子機制決定,而非自然選擇的結果。染色體數目異常是造成某些先天性出生缺陷的重要原因。這一研究結果將有助于研究人類染色體重組規律,探索先天性出生缺陷的遺傳機理。

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案例二 單細胞全基因組及外顯子組測序揭示乳腺癌克隆進化模式

Clonal Evolution in Breast Cancer Revealed by Single Nucleus Genome Sequencing

期刊:Nature
影響因子:41.456
發表單位:The University of Texas MD Anderson Cancer Center, Department of Genetics
發表年份:2014年8月

一、研究背景

大量的乳腺癌研究已鑒別出許多普遍的基因突變,但是對于腫瘤基因組多樣性的研究知之甚少。在乳腺癌的5種分子亞型中,ER-/PR-/Her2-亞型具有的突變數量最多,而ER+/PR+/Her2-亞型突變負荷最低,兩者在克隆結構多樣性及變異進化上可能存在不同。

二、方法流程

取材

1位ER+/PR+/Her2-亞型(ER)患者和1位ER-/PR-/Her2-亞型(TNBC)乳腺癌患者

測序

1. Illumina HiSeq 2000
2. ER
WGS:tumor 46×、normal 54×
CNV檢測:50個腫瘤單細胞
WGS:4個腫瘤單細胞
WES:59個腫瘤單細胞
3. TNBC
WGS:腫瘤組織(72×);正常組織(74×)
WES:16個正常單細胞;16個腫瘤單細胞

分析

1. 與人類參考基因組進行比對
2. 檢測somatic mutation
3. 高頻突變基因篩選
4. 克隆進化分析
5. 腫瘤單細胞之間及腫瘤單細胞與腫瘤組
    織間相同/特有突變

三、研究結果

1. 克隆多樣性和突變進化

通過腫瘤細胞之間的比較發現沒有兩個單細胞突變信息是完全一致的。在兩個患者中發現有大量的各自的亞克隆和de novo突變,說明點突變是一個伴隨著腫瘤細胞分裂增殖長期累計的過程,最終導致克隆的多樣性。研究還發現,拷貝數的進化相似度很高,說明染色體重排發生較早。

2. 耐藥突變與化療

本研究發現大量的耐藥突變存在于化療前的腫瘤組織中,同時也發現增變基因表型有重要含義,指出腫瘤的進化是由增長的突變率驅動的。

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四、研究結論

通過對ER-/PR-/Her2-及ER+/PR+/Her2-兩種分子亞型的患者成對采集腫瘤及正常組織樣品,對腫瘤組織、腫瘤單細胞分別進行全基因組及外顯子組測序。研究發現CNV在單細胞測序結果之間表現出高度相似性,提示染色體重排發生時期較早,在克隆發展過程中穩定傳遞給子代克隆;SNV在子代克隆間表現出多樣性,提示SNV是在腫瘤細胞多次分裂增殖的過程中逐漸產生和積累的。此外,通過數學模型和生物信息學手段揭示了兩種分子亞型的腫瘤在突變率上存在差異。

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