Hi-C測序

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經典案例

案例一 Hi-C技術揭示CTCF位點分化與染色質結構域進化相關

Comparative Hi-C Reveals that CTCF Underlies Evolution
of Chromosomal Domain Architecture

期刊:Cell reports
影響因子:8.358
發表單位: Cancer Institute, University College London
發表年份:2015年3月

一、研究背景

CTCF(CCCTC-binding factor)是廣泛存在于真核生物中的多功能轉錄因子,又名11鋅指蛋白,與絕緣子(真核生物基因組的調控元件之一,功能為阻止臨近調控元件,對它所界定基因的啟動子起增強或者阻遏的作用)的活性密切相關。人類基因組有將近一萬五千個CTCF絕緣體位點,說明CTCF在基因調控方面的功能非常廣泛。2015年3月,VietriRudan等報道了利用Hi-C技術研究揭示CTCF具有促進基因組結構變化的重要作用。這項研究比較了四種哺乳動物的CTCF作用位點,呈現了絕緣子位點分化與染色質結構域的進化存在直接聯系,該成果發表于Cell Reports(IF=8.358)上,為轉錄因子的研究提供了新的思路與方法。

二、方法流程

取材

小鼠、兔子、猴子、狗的肝細胞,每個物種的細胞量達到1~5X107個

建庫

1. 甲醛固定
2. HindIII酶切
3. 末端修復,加生物素
4. 連接酶連接
5. 提取DNA
6. 磁柱純化

測序

利用HindIII進行酶切,PE75測序,測序平臺為Illumina HiSeq

分析

1. CTCF結合位點分析
2. CTCF的進化動態與染色體的
    拓撲結構域的相關性
3. 通過Hi-C數據比較染色體拓
    撲結構域
4. CTCF結合的變異驅動染色體
    結構的變異

三、研究結果

1. CTCF作用機制

CTCF和粘連蛋白通過形成穩定的染色質環對基因發揮作用,這種CTCF/粘連蛋白錨定的環狀結構廣泛分布于基因組上,不僅包括標定拓撲結構域邊界的環狀結構,而且包含存在于這些結構域中的環狀結構。

2. 序列變異驅動CTCF結合變異

CTCF識別并結合特異的核酸序列,小鼠、狗和獼猴中CTCF ChIP-seq表明CTCF強結合的染色質區域序列比較保守。而序列的變異導致CTCF能力的改變,并最終影響CTCF的結合。這些結果表明序列的變異驅動了CTCF結合的變異。

3. CTCF的進化動態與染色體的拓撲結構域的相關性

小鼠肝細胞的Hi-C數據表明保守的CTCF位點傾向于染色體結構域的邊界,而物種特異的CTCF位點傾向于染色體結構域內部。這表明CTCF的進化動態與染色體的拓撲結構域是相關的。

4. 通過Hi-C數據比較染色體拓撲結構域

鼠、獼猴、狗、兔中Hi-C數據表明它們的拓撲結構域具有相似性,它們的差別主要在拓撲結構域內部。比較狗與小鼠的染色體拓撲結構發現那些保守的結構域比不保守的結構域要小一些。

5. CTCF結合的變異驅動染色體結構變異

CTCF結合與否改變了染色體結構域內部的結構,而更大尺度上的結構域則不受CTCF結合改變的影響。那些部分保守的CTCF位點(比如在小鼠和狗中存在而在獼猴中不存在),當不存在時絕緣子效應降低。這表明,CTCF結合的變異驅動了染色體結構的變異。

6. 不同的拓撲結構域之間彼此存在聯系

在鼠和狗保守的CTCF位點中有94%在方向上也是保守的,這表明CTCF位點具有方向性。另外不同的拓撲結構域之間彼此存在聯系。

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四、研究結論

CTCF識別并結合特異的核酸序列,小鼠、狗和獼猴中CTCF ChIP-seq表明CTCF強結合的染色質區域序列比較保守。CTCF結合與否改變了染色體結構域內部的結構,而更大尺度上的結構域則不受CTCF結合改變的影響。

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案例二 利用臨位連接技術和高通量測序技術
構建全基因組單倍型圖譜

Whole-genome haplotype reconstruction using proximity-ligation
and shotgun sequencing

期刊:Nature biotechnology
影響因子:41.514
發表單位: Ludwig Institute for Cancer Research
發表年份:2013年11月

一、研究背景

將高通量測序技術和臨位連接技術相結合,利用臨位連接技術將變異信息連接到一個單體型中。因此實驗如何恢復和保持DNA的空間結構成為難點。基于臨位連接技術,利用30×數據可以準確的(99.5%)重建雜交小鼠細胞中涵蓋95%等位基因的染色體跨度的單倍型。另外,由于人類基因組存在低密度變異,在17×數據的條件下,我們利用HaploSeq 和LCP法獲得了涵蓋染色體81%長度的單體型和98%的準確性。

二、方法流程

取材

1. 小鼠胚胎干細胞F123細胞系
2. 人類GM12878細胞系

建庫

1. 甲醛固定
2. HindIII酶切
3. 末端修復,加生物素
4. 連接酶連接
5. 提取DNA
6. 磁柱純化

測序

PE75

分析

1. 小鼠染色體跨度單體型構建
2. 人類染色體跨度單體型構建

三、研究結果

1. 染色體內和染色體間的reads分布

使用GATK進行變異檢測,并進行分型。用HapCUT進行定位,小鼠的基因組上大約22%的reads為染色體間相互作用,人的基因組上大約55%的reads為染色體間相互作用。

2. HaploSeq實驗策略

研究者發現CAST和J129(小鼠胚胎干細胞來源親本)中大部分的互作信息為染色體內互作,而染色體間互作關系較少,這種現象被稱為染色體疆域。同時,Hi-C的結果表現出更多的是順式調控作用,反式調控作用只占到很小的比例。

3. 小鼠胚胎干細胞生成單體型

使用HapCUT軟件進行單體型分析,使用小鼠Hi-C實驗中成對的reads進行單體型判斷,并與已知的親本CAST和J129來進行驗證。研究者采用不同的建庫方式進行單體型構建,結果表明只要有Proximity ligation(臨位連接技術)就能對單體型圖譜的長度和飽和度均有質的提升。

4. 人類個體單體型分析

研究者利用公用的1,000個人的GM12878基因組全基因組重測序數據,進行染色體跨度單體型構建。利用haploseq分析,獲得了人類完整的單體型圖譜,包括X染色體,其分辨率達到22%。與已公布的人類單體型數據進行比較,其準確度高達98%。

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四、研究結論

研究者發現CAST和J129(小鼠胚胎干細胞來源親本)中大部分的互作信息為染色體內互作,而染色體間互作關系較少,這種現象被稱為染色體疆域。同時研究也表明表明,每個等位基因占有不同染色體區域,染色體間的互動頻率在小于2%。利用haploseq分析,獲得了人類完整的單體型圖譜,包括X染色體,其分辨率達到22%,準確度達到98%。

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