單細胞轉錄組測序

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經典案例

案例一 單細胞轉錄組測序研究人類著床前胚胎細胞及胚胎干細胞

Single-cell RNA-Seq profiling of human preimplantation embryos and embryonic stem

期刊:Nature Structural & Molecular Biology
影響因子:11.633
發表單位:北京大學
發表年份:2013年8月

一、研究背景

運用單細胞轉錄組測序技術,研究了處于7個發育階段的124個人類著床前胚胎細胞及胚胎干細胞的基因表達情況。

二、方法流程

取材

1. 選取卵母細胞、受精卵、2細胞
    胚、4細胞胚、8細胞胚、桑葚胚
    等著床前的胚,用顯微吸取法
    分離得到單細胞;
2. 每組設3~30個生物學重復。

建庫

1. 單細胞cDNA 擴增;
2. Illumina Truseq DNA
    preparation Kit構建測序文庫。

測序

1. Illumina HiSeq 2000 PE100;
2. 每個樣本20~60 M clean reads,
    124個樣本共產出438 Gb data。

分析

1. 與參考基因組比對
2. 基因表達分析
3. 可變剪切分析
4. lncRNA篩選及表達分析
5. 基因差異表達分析

三、研究結果

1. 基因表達分析

在90個胚胎細胞中,平均有 11,006個基因和18,022個轉錄本表達,分別占22,092個已知基因和36,983個已知轉錄本的49%和48%。

2. 可變剪切分析

平均有4,822個基因至少含有2個已知的可變剪切isoforms,981個基因含有2個以上的可變剪切isoforms,最多可達7個 isoforms。

3. lncRNA表達分析

在90個胚胎細胞中,共檢測到18,383個lncRNA,平均每類細胞表達3,337個,分別占28,640個已知lncRNA的64%和11%。lncRNA可調控胚胎發育過程。

4. EPI與hESC轉錄組比較

人類外胚層細胞EPI與人類胚胎干細胞hESC在轉錄水平上差異巨大,兩種細胞間共檢測到1,498個差異基因。

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四、研究結論

通過單細胞轉錄組測序技術,對處于7個發育時期的90個人類胚胎細胞及34個由胚囊分化而來的人類胚胎干細胞進行了研究,發現了不同發育階段及不同細胞特異表達的基因及lncRNA,為解析人類早期胚胎發育的分子調控機制及鑒定人類胚胎干細胞的多能性和分子特征奠定基礎。

案例二 單細胞轉錄組測序揭示人CD127+先天淋巴細胞的異質性

The heterogeneity of human CD127+ innate lymphoid cells
revealed by single-cell RNA sequencing

期刊:Nature Immunology
影響因子:24.973
發表單位:瑞典卡羅林斯卡學院
發表年份:2016年2月

一、研究背景

先天淋巴細胞(ILCs)是一種免疫細胞,它通過釋放可溶性的因素調節對病毒、細菌和寄生蟲的早期免疫反應。這些細胞可以根據細胞表面的轉錄因子及細胞因子被分為三個亞型,每種亞型都有不同的功能。

二、方法流程

取材

用流式細胞儀分選患有阻塞性睡眠呼吸暫停綜合癥患者的扁桃體組織中的ILCs(Lin?CD127+)和NK cells(CD45+Lin?CD127? NKG2A+CD56+CD16? ) 。

建庫

1. Smart-seq2進行單細胞擴增;
2. Nextera XT DNA Sample
    Preparation Index Kit構建
    文庫。

測序

Illumina HiSeq 2000
3×106reads /樣本

分析

1. 質控、數據篩選;
2. 序列比對、基因表達分析及標準
    化處理;
3. t-SNE細胞分型分析;
4. SCDE基因差異表達分析。

三、研究結果

1. 細胞分型分析

采用PCA(主成分分析)和t-SNE對ILC中847個表達的基因進行分型分析,將細胞分為4類:ILC1、ILC2、ILC3、NK cells。

2. SCDE基因差異表達分析

應用SCDE軟件包對4類細胞的差異基因進行分析,找出共有及特有差異基因,結果發現,CD127+ILCs中共有的差異基因的表達量比NK細胞中明顯要高。

3. ILC1、ILC2、ILC3差異基因表達分析

結果表明,ILC1 cells共有79個上調表達基因,參與干擾素γ的調控,ILC2 cells共有58個上調表達的基因,在前列腺素、Notch信號通路及環境感應中發揮作用,ILC3 cells共有371個上調表達的基因,根據GO注釋有85個與免疫相關,且存在未知功能的基因。

4. ILC3細胞亞型分析

采用PCA和t-SNE分析ILC3中1,958個注釋的免疫基因,將ILC3分為3個亞型:Cluster A、Cluster B、Cluster C, 通過對這3種亞型細胞的分析,發現了新的免疫細胞CD62L+ ILC3。

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四、研究結論

本研究通過對648個單細胞進行單細胞轉錄組的分析,應用t-SNE細胞分型、SCDE基因差異表達分析,在ILC3中發現新的免疫細胞CD62L+ ILC3。

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